簡(jiǎn)介

在利用大腸埃希菌表達(dá)重組蛋白時(shí)，經(jīng)常會(huì)得到包含體。包含體分離純化難度大，只有在變性后才能形成可溶性的形式予以純化。純化后的變性蛋白質(zhì)需要重新復(fù)性（renaturation），才能折疊成正確的天然構(gòu)象和恢復(fù)原有的生物活性。

原理

包含體是細(xì)胞感染病毒后胞漿或核中出現(xiàn)的特殊結(jié)構(gòu)。 常用于病毒病的診斷。 根據(jù)病毒種類(lèi)，包含體表現(xiàn)大小不一，形態(tài)各異，單一或多個(gè)，嗜酸或嗜堿。 它代表著病毒粒子的合成場(chǎng)所，故又稱(chēng)病毒工廠（virus factory）或病毒原質(zhì)體（viroplasma）。包含體分離純化難度大，只有在變性后才能形成可溶性的形式予以純化。純化后的變性蛋白質(zhì)需要重新復(fù)性（renaturation），才能折疊成正確的天然構(gòu)象和恢復(fù)原有的生物活性。

材料與儀器

試劑：

溶菌酶、EDTA、Tris、去垢劑 Triton X-100、尿素

儀器：

超聲破碎儀、離心機(jī)、凝膠層析柱、透析袋

步驟

（一）裂菌、洗滌及溶解

1．裂菌利用溶菌酶破碎細(xì)菌的細(xì)胞膜，再結(jié)合超聲破碎方法裂解細(xì)菌。細(xì)菌裂解后，5000～20000 g 離心 15 分鐘，可以使大多數(shù)包含體沉淀，與可溶性蛋白分離開(kāi)。

2．洗滌為了棄除包含體上黏附的雜質(zhì)，通常用低濃度的變性劑，如含 2mol/L 尿素的 1 mmol/LEDTA（50 mmol/L Tris，pH7.0～8.5）洗滌。過(guò)高濃度的尿素或鹽酸胍會(huì)使包含體溶解。溫和的去垢劑 Triton X-100 和脫氧膽酸也可以棄除膜碎片和膜蛋白。

3．溶解利用 6～8 mol/L 尿素或 5～8 mol/L 鹽酸胍將包含體溶解。鹽酸胍是強(qiáng)于尿素的變性劑。

（二）變性蛋白質(zhì)的復(fù)性

1．復(fù)性過(guò)程蛋白質(zhì)在尿素濃度為 4 mol/L 時(shí)開(kāi)始復(fù)性，到 2 mol/L 時(shí)復(fù)性結(jié)束。對(duì)于鹽酸胍而言，從濃度為 4 mol/L 開(kāi)始復(fù)性，到 1.5 mol/L 時(shí)復(fù)性結(jié)束。常用的包含體蛋白質(zhì)復(fù)性方法有疏水層析柱復(fù)性和凝膠層析柱復(fù)性兩類(lèi)。凝膠層析柱復(fù)性均用 Sephacryl S-100 或 Superdex 75 等層析介質(zhì)，層析柱的長(zhǎng)度為 40～100 cm。層析柱復(fù)性回收率高（高達(dá) 90% 以上）、速度快、易于放大、樣品稀釋倍數(shù)?。ㄒ话?5 倍左右）。

2．復(fù)性效率蛋白質(zhì)復(fù)性取決于蛋白質(zhì)本身的特性以及所處的環(huán)境。有些蛋白非常容易復(fù)性，如牛胰 RNA 酶的復(fù)性效率可以達(dá)到 95% 以上，但有一些蛋白至今還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)能夠使其復(fù)性到天然構(gòu)象的理想方法。純化白細(xì)胞介素-2 時(shí)，以 SDS 溶液中加入銅離子（0.05% SDS，7.5～30 μmol/L CuCl2）的方法，25～37 ℃ 下反應(yīng) 3 小時(shí)，再用 1 mmol/L EDTA 終止反應(yīng)，復(fù)性后的二聚體低于 1%。一般說(shuō)來(lái)，蛋白質(zhì)的復(fù)性效率應(yīng)在 20% 左右。

3．影響復(fù)性效率的因素復(fù)性緩沖液的最適 pH 是 8.0～9.0，最適溫度為 4 ℃，復(fù)性時(shí)間一般為 24～36 小時(shí)。復(fù)性時(shí)的蛋白質(zhì)濃度應(yīng)該控制在 0.1～0.5 mg/ml，過(guò)高的濃度會(huì)影響到復(fù)性。在磁力攪拌下，逐滴將變性的蛋白質(zhì)加入復(fù)性液中，使變性的蛋白質(zhì)在復(fù)性緩沖液中始終處于低濃度狀態(tài)。如果過(guò)快地將變性蛋白質(zhì)加入到復(fù)性緩沖液中，容易形成絮狀沉淀，這是蛋白質(zhì)重新凝聚的前兆。

復(fù)性完畢后，蛋白質(zhì)要裝入透析袋，在低濃度的緩沖液中連續(xù)緩慢透析 12～24 小時(shí)；透析不能太快；透析前后均要離心。

4．提高包含體蛋白復(fù)性產(chǎn)率的方法在包含體蛋白質(zhì)復(fù)性過(guò)程中，加人促進(jìn)劑可以增加折疊復(fù)性中間體的溶解性，導(dǎo)致形成穩(wěn)定的、具有正確天然結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。

（1）添加氧化交換系統(tǒng)：對(duì)于含有二硫鍵的蛋白，復(fù)性過(guò)程通過(guò)氧化交換系統(tǒng)可以促使不正確的二硫鍵配對(duì)發(fā)生快速交換反應(yīng)，從而提高了正確配對(duì)的二硫鍵的產(chǎn)率。常用的氧化交換系統(tǒng)有谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）、DTT/GSSG 等，其中 GSH/GSSG 最為常用。通常使用 1～3 mmol/L 還原型巰基試劑，還原型和氧化型巰基試劑的比例通常為 10:1～5:1。

（2）添加小分子化合物：小分子化合物通過(guò)破壞錯(cuò)誤折疊中間體的穩(wěn)定性，或增加折疊中間體和未折疊分子的可溶性來(lái)提高復(fù)性產(chǎn)率，如鹽酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺類(lèi)等，在非變性濃度下是很有效的促進(jìn)劑。蛋白質(zhì)的輔助因子 Zn＋ 或 Cu＋ 可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的折疊中間體，防止蛋白質(zhì)的聚集。濃度大于 0.4 mol/L 的 Tris 緩沖液可提高包含體蛋白質(zhì)的折疊效率，濃度為 0.4～0.6 mol/L 的 L-Arg 有助于增加復(fù)性中間產(chǎn)物的溶解度。硫代甜菜堿類(lèi)物質(zhì)（non-detergent sulfobetaines，NDSBs）是近年來(lái)出現(xiàn)的可促進(jìn)蛋白復(fù)性的新家族，NDSBs 由一個(gè)親水的硫代甜菜堿及一個(gè)短的疏水基團(tuán)組成，不屬于去垢劑，易于透析去除。目前常用的有 NDSB-195，NDSB-201 和 NDSB-256。

（3）添加分子伴侶和折疊酶：研究得比較透徹的分子伴侶有 Hsp60/GroE 和 Hsp70/DnaK。折疊酶包括硫氧還蛋白二硫鍵異構(gòu)酶、肽酰輔氨酰順?lè)串悩?gòu)酶等。但這類(lèi)蛋白在折疊復(fù)性后要除去，而且十分昂貴，因此采用可回收利用的方法如固定化法為好。

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